前言
老龄化相关疾病的患病率高、预后较差。而探寻合适的衰老模型，预防衰老相关性疾病具有重要意义。文章通过研究小鼠甲状腺*症与衰老的关系，采用LC-MS、GC-MS非靶代谢组学及DIA蛋白质组学结合的方法，分析内源性代谢组和血清蛋白质组的变化。为甲状腺*症小鼠衰老模型的建立及探索抗衰老药物研发提供新思路。
年06月，鲁南制药集团股份有限公司冯芹和张贵民研究员课题组在FrontiersinImmunology期刊发表了题为“TheAgingFeaturesofThyrotoxicosisMice:Malnutrition,ImmunosenescenceandLipotoxicity”的研究成果，通过LC-MS、GC-MS非靶代谢组学和DIA蛋白质组学研究方法，描绘了血清蛋白质组和内源性代谢图谱，发现了小鼠甲状腺*症与衰老特征，探究了甲状腺*症与衰老疾病的机理，为探究衰老机制及抗衰老药物的研发提供了理论依据。
中文标题：甲状腺*症小鼠的衰老特征：营养不良，免疫衰老与脂*性
研究对象：小鼠
发表期刊：FrontiersinImmunology
影响因子：8.
发表时间：年6月
合作单位：鲁南制药集团股份有限公司
运用生物技术：LC-MS非靶代谢组学、GC-MS非靶代谢组学、DIA蛋白质组学（由欧易/鹿明生物提供技术支持）
研究思路
研究方法
1.实验分组
（1）对照组：雌性KM小鼠
（2）模型组：雌性KM小鼠+口服甲状腺素片混悬液
2.技术路线
2.1血常规检查：EDTAK2抗凝剂、自动血液分析仪、流式细胞术检测CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的阳性率、PerCP-Cy5.5小鼠外周血CD3、FITC标记大鼠抗小鼠CD4抗体、APC-H7大鼠抗小鼠CD8a、PE大鼠抗小鼠IFN-γ
2.2CD4+IFN-γ+T淋巴细胞检测：IFN-γ+T淋巴细胞、CytoFLEX流式细胞仪
2.3血清生化分析：BS-全自动生化分析仪
2.4血清蛋白质组测定：DIA-MS
2.5血清LC-MS非靶代谢组学：ACQUITYUHPLC联合ABSCIEXTripleTOF
2.6血清GC-MS非靶代谢组学:AgilentBGC联合AgilentAMSD
2.7粪便LC-MS非靶代谢组学：DionexUltimateRSUHPL
3.统计分析：
ANOVA、alog-ranktest、DIA、OPLS-DA、S-t检验、Pearsoncorrelation、R软件、Metascape、STRING、progenesisQ、CytExpert、SpectronautPulsa
研究结果
1、不同血细胞计数和生化指标的变化
血常规检测结果显示白细胞（WBC）、中性粒细胞（NEUT）、淋巴细胞总数（淋巴）、红细胞（RBC）、血红蛋白（HGB），红细胞压积（HCT）和血小板（PLT）均下降，表明过量甲状腺素会引起全血细胞减少（表1）。
小鼠连续摄入过量甲状腺素20天后，转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）显著升高，表明小鼠有肝损伤。总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）和球蛋白（Glb）水平显著降低，表明过量的甲状腺素导致低蛋白血症或低白蛋白血症。总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDC-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平显著降低，而甘油三酯（TG）水平显著降低显著升高，表明甲状腺*症小鼠有低胆固醇血症、低脂血症和高脂血症。
表1
甲状腺*症小鼠不同血细胞计数和生化指标的变化
2、淋巴细胞亚群和功能的变化
与正常对照组比，甲状腺*症小鼠的CD3+CD4+百分比显著下降，而CD3+CD8的百分比显著增加，所以CD4+/CD8+的百分比下降明显。CD3+CD4+IFN-γ+的百分比也显著降低（图2）。
图2
淋巴细胞亚群和功能的变化
3、甲状腺*症小鼠与正常小鼠血清蛋白质组比较分析
PCA分析表明，甲状腺*症小鼠与正常小鼠两组之间有差异（图3A）。DIA蛋白质组学分析了甲状腺*症小鼠中种差异表达的蛋白（DEPs），其中6种上调，种下调（图3B）。Metascape在线分析法对种下调蛋白进行了分析（图3C）。
图3
比较蛋白质组学分析
STRING分析了补体、凝血级联、Alb和Ttr（图4A）。血液凝固通路和抗凝纤溶因子均被下调，而在这些下调蛋白中，32种与免疫系统相关，表明体液免疫应答下降。大量免疫球蛋白下调，表明适应性免疫系统也随之下降（图4B）。对Alb、Trf以及补体和凝血级联进行相关分析，结果表明Alb与补体和凝血级联中的DEPs呈正相关（图4C-D）。
图4
补体和凝血级联中下调的DEPs
通过STRING在线分析，发现许多DEPs与体内平衡有关，负责脂质运输、离子运输和维生素运输。它们的下调表明脂质、离子和化学物质的体内平衡被破坏，影响甲状腺*症小鼠系统的多细胞有机体发育（图5A）。此外，下调的DEPs与多细胞生物的发育直接相关（图5B）。
图5
下调的DEPs与体内平衡和多细胞有机体发育有关
4、血清LC-MS代谢组学分析结果及其与蛋白质组学的相关性
甲亢组和正常组之间的OPLS-DA评分存在显著差异。基于LC-MS代谢组学鉴定并量化了血清中种代谢物，其中种为差异表达代谢物（DEMs）。
KEGG途径分析表明，DEMs富含类固醇激素生物合成、初级胆汁酸生物合成、胆汁分泌、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成、花生四烯酸代谢、鞘脂信号通路等途径。在Alb和C1qb显著相关的条件下，LC-MSDEMs中筛选出20个DEMs，其中下调的DEMs与下调的DEPs呈正相关（图6）。
图6
血清LC-MS代谢组学分析及其与蛋白质组学的相关性
5、血脂代谢组学分析结果及其与蛋白质组学的相关性
基于Lipidmaps数据库，LC-MS代谢组学鉴定并量化了血清中种脂质代谢物，其中种为差异表达代谢物（DEMs），包括种上调和种下调。血脂DEMs与DEPs进行相关性分析，在与Alb和C1qb显著相关的条件下，筛选出13个脂质DEMs（图7）。
图7
血脂代谢组学分析及其与蛋白质组学的相关性
6、血清GC-MS代谢组学分析结果及其与蛋白质组学的相关性
甲亢组和正常组之间的OPLS-DA评分存在显著差异。GC-MS代谢组学鉴定并定量检测了种血清中的代谢物，其中80种为差异表达代谢物（DEMs，13种上调，67种下调）。
KEGG途径分析表明，DEMs在蛋白质消化和吸收、氨酰tRNA生物合成、氨基酸生物合成、矿物质吸收、ABC转运体等途径中富集。Alb和C1qb同时显著相关的条件下，筛选出10了个脂质DEMs。其中，下调的DEMs与下调的DEPs呈正相关，上调的DEMs与下调的DEPs呈负相关。
图8
血清GC-MS代谢组学分析
7、粪便LC-MS代谢组学分析结果
甲状腺*症组和正常组之间的OPLS-DA评分有显著差异。基于LC-MS代谢组学鉴定并定量了种代谢物，其中种为差异表达代谢物（DEMs）。
KEGG途径分析表明，DEMs富含花生四烯酸代谢、甾体激素生物合成、亚油酸代谢、神经活性配体受体相互作用等途径。DEMs的分类表明，氨基酸、肽及类似物大多数被上调。在甲状腺*症小鼠的粪便中，雄甾烷甾体、胆甾烷甾体、胆汁酸、醇及其衍生物、孕烷甾体、二十碳烯酸、脂肪酸酯、羟基甾体、亚麻酸及其衍生物显著下调。
大多数DEMs是二肽，它们可能无法通过KEGG分析，因此并未在图中显示。二肽应在蛋白质消化和吸收途径中的上调，表明氨基酸和二肽会随着粪便的排泄而丢失，这也是低蛋白血症的原因（图9）。
图9
粪便LC-MS代谢组学分析
8、血清质谱结果的一致性和准确性
LC-MS和GC-MS同时检测血清中的DEMs，其结果是一致的。LC-MS检测到TGs上调，GC-MS检测到胆固醇下调，LC-MS/MS检测到Alb下调与生化试验结果一致（表2）。DEPs中的Apoa1、Apoa2和Apoa4代表HDL，它们的下调与生化试验中HDL-C的结果一致。总共有25种免疫球蛋白或片段在DEPs、Jchain、Igkc和Ighg中被发现下调选择其为代表，生化试验结果与Glb一致。所有的比较都证明了MS检测结果的准确性。
表2
不同检测方法下DEM和DEP的一致性
相关讨论
研究发现血常规显示过量的甲状腺素导致了白细胞总数减少。流式细胞术检测出的甲状腺*小鼠CD4/CD8比值和CD4+IFN-γ+T细胞数量减少，表明发生了免疫衰老。DIA蛋白质组学分析显示了免疫功能下降。脂*性代谢产物的上调是免疫衰老的原因。
研究结论
文章通过LC-MS和GC-MS非靶代谢组学联合DIA蛋白质组学方法，检测甲状腺*症小鼠的血清蛋白和脂质代谢物等，并从营养、代谢、免疫、内分泌角度分析甲状腺*症与衰老疾病的关系。研究发现脂质代谢紊乱、营养不良、免疫衰老和脂*性，是引发衰老相关疾病的机制。通过本研究不仅可用于衰老相关疾病的预防，也可用于新药的研发。
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文章通过LC-MS、GC-MS非靶向代谢组学技术与DIA蛋白质组学技术，以甲状腺*症模型为基础探究衰老疾病的机制，并为抗衰老药物的研发提供新思路。
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